PROJECT  SUMMARY:  Hypothermia,  the  only  current  clinical  option  for  organ  storage,  allows  storage  times  measured in only hours during which the organ deteriorates. This is the main reason why high percentages  of  organs  from  suitable  donors  are  not  being  utilized  and  the  majority  of  donated  organs  are  discarded.  It  also  explains why almost all organs are not optimally donor-­recipient matched, contributing to 50% of organs  being rejected within 10 years and life-­long immunosuppression. We recently demonstrated that reducing  storage temperatures while avoiding freezing with supercooling can extend storage times without the added tissue  injury  from  cryopreservation  or  deleterious  phase  changes,  with  successful  transplants  in  rats  after  up  to  4  days  preservation.  While  groundbreaking  experimentally,  this  is  still  insufficient  in  terms  of  global  organ  matching  or  time to induce immune tolerance by mixed chimerism, which we estimate will require 1 week preservation -­  our  overall  ultimate  objective.  Moreover,  supercooling  is  a  non-­equilibrium  state  with  the  inherent  risk  of  ice  nucleation  and  freezing  at  subzero  temperatures.  The  innovation  we  propose  here  is  to  use  established  physical principles to enable equilibrium sub-­cooling that is stable at subzero temperatures irrespective of  sample volume or time of storage. We propose to develop a non-­toxic solution to bank whole human organs that  can  enable  global  organ  matching,  increase  the  use  of  marginal  donor  organs,  and  revolutionize  organ  transplantation.  Our  approach  will  develop  a  nature-­inspired  cocktail  that  enables  stable  human  organ  subzero nonfreezing storage (in the range of -­5 to -­20 °C). Such strategies are used in nature to survive weeks  at temperatures as low as -­14°C in a state of ‘suspended animation,’ with the whole animal, including every single  organ, being “banked” without injury. Further, we recently demonstrated that a combination of machine perfusion  and  subzero  nonfreezing  storage  at  -­6°C  tripled  viable  preservation  times  of  banked  whole  rat  livers  for  transplantation with 100% survival. Based on this preliminary work we conceived a two-­pronged approach in which  our  first  generation  supercooling  protocol  is  augmented  with  cryostasis  protocols  designed  using  new  equilibrium  calorimetry data for a range of novel cryostasis cocktails to remain unfrozen at high subzero temperatures. This is  achieved  by  restricting  cooling  to  temperatures  above  the  equilibrium  melting  curve  defined  in  a  phase  diagram.  These new solutions and protocols will then be evaluated using human cell models before assessing this combined  approach in rat studies and testing with transplants.  Finally we will preserve whole human livers in a SZNF state as  proof of concept.   Our milestone in this R21 study is demonstration of this augmented protocol in human livers at 3  days, which would represent a >5-­10 fold increase over current clinical practice. In follow-­up studies we  will extend this limit to 1 week and test with porcine survival transplants.

PUBLIC HEALTH RELEVANCE STATEMENT    There  are  currently  over  123,000  patients  on  the  organ  transplant  waiting  list  in  the  US,  a  number  that  far  exceeds  the  supply  of  available  organs,  and  that  continues  to  grow  ~5%  each  year;;  other  all-­comprehensive  estimates suggest that as many as 35% of all US deaths could potentially be prevented by complete access to  organs-­on-­demand.    A  major  reason  is  the  limitations  of  our  current  organ  preservation  technology,  which  inures  the  organ  during  storage  and  also  contributes  to  the  need  for  life-­long  immune  suppression  and  disallows the transplantation of marginally injured organs.   This project aims to improve public health by enabling the use of currently discarded donor livers and better  matching  of  all  livers  by  developing  a  superior  preservation  method  which  enhances  the  graft  viability  and  extends  total  storage  duration.    It’s  also  provides  a  platform  to  help  enable  immune  tolerance  induction/chimerism protocols also in cases of deceased donor organ transplantation.