Project Summary/Abstract  Current anti-­HIV-­1 therapies prevent progression to AIDS but do not cure infection. HIV-­1 persists in long-­lived  memory CD4+ T cells as a transcriptionally silent provirus, where it is undetectable by the immune system, and  therefore  resistant  to  extirpation.  Recently,  we  reported  that  primate  immunodeficiency  virus  Vpx  and  Vpr  proteins  activate  HIV-­1  provirus  transcription  by  degrading  the  three  proteins  of  the  human  silencing  hub  (HUSH)  complex.  Disruption  of  the  HUSH  complex  in  bulk  CD4+  T  cells  increased  transcription  from  HIV-­1  proviruses and kinetics of HIV-­1 spreading infections, indicating that the HUSH complex plays a dominant role  in HIV-­1 provirus silencing. Nonetheless, examination of individual clones showed heterogeneity in response to  HUSH disruption, and inconsistent correlation with known silencing factors such as SETDB1. Aim 1 will be to  identify  requirements  for  HUSH  complex  silencing  of  the  HIV-­1  provirus.  Sets  of  CD4+  T  cell  clones  bearing  HIV-­1  proviruses  that  exhibit  a  range  of  HUSH  responsiveness  will  be  subjected  to  loss-­of-­function  screens to identify host silencing factors that distinguish clones with different HUSH phenotypes. Such factors  will be characterized independently for effects on provirus transcription and provirus chromatin features. From  these  experiments  we  expect  to  better  understand  how  HUSH  is  recruited  to,  and  maintains  transcriptional  silencing  of,  HIV-­1  proviruses.  Aim  2  will  be  to  examine  the  role  of  the  HUSH  complex  in  CD4+  T  cell  transcription and development. Disruption of the HUSH complex activates LINE-­1 expression in certain cell  lines  raising  questions  about  possible  consequences  of  HUSH  complex  disruption.  Global  transcription  and  chromatin profiling will be performed on primary human CD4+ T cells in which HUSH complex components are  disrupted.  Increased  expression  of  particular  retrotransposons  is  expected,  but  also  immune-­related  genes  of  relevance  to  HIV-­1,  and  markers  that  may  be  used  to  monitor  HUSH  complex  activity  in  cells.  Examination  of  transcription factor motifs within lost ATAC-­Seq peaks will aid identification of DNA-­binding proteins that recruit  the HUSH complex. The HUSH complex will also be disrupted in cord blood human CD34+ hematopoietic stem  cells  used  to  reconstitute  an  immune  system  in  mice.  These  experiments  will  tell  us  whether  the  HUSH  complex  is  essential  for  human  hematopoietic  development  generally  or  for  CD4+  T  cells  specifically.  Aim  3  will  assess  the  contribution  of  the  HUSH  complex  to  HIV-­1  latency  in  vivo.  The  effect  of  HUSH  complex  inactivation  on  HIV-­1  provirus  reactivation  will  be  examined  with  CD4+  T  cells  harvested  from  HIV-­1+  individuals  on  anti-­HIV-­1  suppressive  therapy  and  from  humanized  mice.  These  studies  are  expected  to  improve  mechanistic  understanding  of  HIV-­1  transcriptional  regulation,  help  prognosticate  the  transcriptional  status  of  a  given  provirus,  develop  new  approaches  for  disrupting  the  HIV-­1  provirus  in  the  clinical  context,  and, more generally, increase fundamental understanding of gene regulation. 

Project Narrative    Anti-­HIV-­1  drugs  prevent  HIV-­1-­infected  people  from  developing  AIDS  but  the  drugs  do  not  cure  infection  because  HIV-­1  becomes  a  permanent  genetic  element  in  human  chromosomes  that  is  called  a  provirus.  We  discovered  that  host cell proteins called the HUSH complex silence the HIV-­1 provirus, making it  difficult  for  drugs,  or  the  immune  system,  to  detect  and  eliminate  the  virus.  The  experiments  proposed  here,  which  are  intended  to  better  understand  how  the  HUSH complex silences the HIV-­1 provirus, are hoped to provide information that  will facilitate efforts to cure HIV-­1 infection.